反义寡核酸技术进展及其ADME

撰文 | 紫薯

2018年3月5日

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Ionis和Biogen最近接连在《NEJM》上发文，进一步评估了其于2016年底获得FDA批准的反义寡核苷酸药物SPINRAZA（nusinersen）治疗晚发型脊髓性肌萎缩症（SMA）患者的疗效和安全性。CHERISH和ENDEAR两个三期临床试验的数据均验证了该药物改善患者运动功能的重要疗效终点，并且证实了有利的收益风险特征。作为第一个，也是目前唯一获得批准的治疗SMA的有效方案，SPINRAZA终于带来了小分子核酸技术的真正突破，其2017年销售额接近9亿美元，未来峰值销售额预计高达30亿美元。

2018生命科学突破奖授予了UCSD的Don W. Cleveland教授，表彰他在阐明一类遗传性肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）的分子发病机制，包括神经胶质在神经变性作用中的贡献，以及在ALS和亨廷顿病的动物模型中建立了有效的反义寡核苷酸疗法。

狗年以来，反义寡核苷酸疗法在工业界、学术界喜讯频传，前景旺旺。这里简要小结一下反义核酸技术的进展及其独特的药代动力学（ADME）特点。

反义寡核苷酸技术简介

Zamecnik和Stephenson在1978年最早发现了反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASOs）作为反义分子的功能，使其成为最早的基于寡核苷酸的治疗方法。虽然在二十年前首次发现ASOs影响RNA的加工和调节蛋白质表达，然而，由于早期设计的ASOs靶标参与不够充分，生物活性不足，以及脱靶毒性等限制因素，阻碍了这些药物进入临床的进展及应用。

一直以来，ASO的新型化学修饰试图解决这些问题，对阐明ASO的作用机制和改进临床试验设计起了重要作用，为基于ASO策略的临床转化提供了动力，特别是针对许多神经疾病的治疗。在过去几年中，这一稳步进展达到了顶峰，ASO药物SPINRAZA得到了FDA的批准用于治疗常规药物难以施展的脊髓性肌萎缩症和Duchenne型肌营养不良症，这代表了反义核酸技术在疾病缓解方面独特的优势。

经典的ASOs通常由13至25个核苷酸组成的单链DNA或RNA分子。最佳的长度在16-20个核苷酸。这样即可以保障高选择性，又不至于因为太大带来PK等成药性的损失。

ASOs与传统的化学药物小分子相比，分子量更大，达6000-7000 kDa，药代动力学与化药小分子也非常不同。而它与大分子蛋白生物制剂也没有多少相似性，是一种非常独立的药物形式。

寡核苷酸与小分子及生物制剂性质比较

ASOs与SiRNAs 的区别及作用机理

RNA干扰（RNAi）这种天然存在的现象作为转录后基因沉默的有效序列特异性机制首先描述于蠕形秀丽隐杆线虫（Fire等人，1998）。后来发现，这种沉默现象也发生在植物、原生动物、真菌和动物中，似乎在所有真核生物中都是保守的，甚至可能在原核细胞中发挥作用。这是内源基因表达/翻译调控和防御病原体的重要过程。

RNA干扰由长双链RNA分子（dsRNA）启动，由Dicer酶将其加工成21-26个核苷酸长度的RNA，称为短干扰RNA（siRNA）。与传统的反义方法相比，单独作为基因沉默技术，RNAi效率优于经典的单链ASOs。理论上，RNAi干扰可用于治疗任何与识别的基因表达升高有关的疾病。

经典的ASOs通常由13至25个核苷酸组成的单链DNA或RNA分子组成，功能更为多变。根据序列和化学修饰，反义寡核苷酸可以通过几种不同的机制改变RNA的功能，使其成为多样化的工具。它们可用于恢复蛋白质表达，减少毒性蛋白质的过量表达，或修饰突变蛋白质以降低其毒性。

如图示：

• 阻断mRNA转录的ASOs，其通过互补mRNA序列的结合，阻止或抑制剪接或翻译的进程。

• 切割降解mRNA的ASOs，其通过结合互补的mRNA序列和募集细胞质核酸酶RNase H来诱导mRNA的降解。

• 靶向特定序列，调控mRNA的剪切，从而形成不同亚型，不同功能的蛋白等。

反义寡核苷酸作用机制：核糖核酸酶H1或剪接的调节

反义寡核酸技术的优缺点

优点：

• 寡核苷酸可以在一周内快速生产，mRNA的序列是唯一所需要的信息；

• 靶点目标通常是一维的（与通常以蛋白质为目标的多维结构不同），通过已知基因的数据库扫描或通过与未知基因的北/南印迹可以测量敏感性；

• 与常规药物靶向抑制蛋白质相比，抑制mRNA表达会产生更快、更持久的临床反应；

• 与范德华力和其他结合蛋白质靶点所需的力量相比，寡核苷酸和mRNA靶标之间的氢键结合力超过几个数量级；

• ASOs在特定的器官和组织如肝、脾、肾、骨髓、脂肪细胞中积累。它们可以通过几种不同途径给药，如直肠、皮下、静脉内、鞘内、玻璃体内、气雾剂甚至口服等。

缺点：

• 针对胞外和胞内降解（主要通过核酸酶的作用）的不稳定性;

• 对靶细胞或组织的细胞内递送效率低；

• 对预期的靶序列有时亲和力不足；

• 潜在的脱靶/毒性作用；

• 最后对于大多数应用来说免疫刺激也是一个值得关注的问题。

ASO化学技术的更新换代

ASO化学修饰的进展一直在稳步进行，虽然进展缓慢。最广泛使用的修饰可分为两类：（a）骨架结构和（b）糖环修饰。

这些化学修饰的主要目标是增加对外切核酸酶和内切核酸酶降解的抵抗力; 增加对靶RNA / DNA序列的亲和力; 提高选择性；并调节寡核苷酸的免疫刺激性质。

1代：第一代ASO注意为骨架修饰，例如用硫（硫代磷酸酯），甲基（甲基膦酸酯）或胺（氨基磷酸酯）代替磷酸酯键的氧原子。其中，硫代磷酸酯是最成功的并用于基因沉默，因为它们对核酸酶有足够的抗性以及诱导RNA酶H功能的能力。磷酯酸寡核苷酸首先在20世纪60年代由Eckstein和他的同事合成，并首先被Matsukura和同事用作反义寡核苷酸（ASON）以抑制HIV复制。然而，一代ASO对靶序列的结合亲和力，特异性和细胞摄取的特征总体不太令人满意。

2代：在第二代寡核苷酸中，与硫代磷酸寡脱氧核苷酸相关的问题在一定程度上得到解决，所述核苷酸在核糖的2'位置具有烷基修饰。 2'-O-甲基和2'-O-甲氧乙基RNA是这一类最重要的成员。 2'-O-甲基和2'-O-甲氧基乙基衍生物可以进一步与硫代磷酸酯键结合。

由这些结构单元构成的反义寡核苷酸的毒性低于硫代磷酸ASO，并且对它们的互补RNA具有略微增强的亲和力。关于其诱导RNA酶H切割靶RNA的效率的问题是二代寡核苷酸的主要缺点。

2.5-3代：已开发出多种核酸类似物，与未修饰的DNA：DNA和DNA：RNA双链体相比，当与互补DNA或RNA杂交时，显示出更高的热稳定性。尽管这些构建体提供了增加的稳定性和有利的杂交动力学，但总体来讲它们有许多新的问题，包括对RNase H切割机制识别降低，溶解度下降和递送困难等。有人称之为3代，但也有人认为改进不足以称为3代，应叫2.5代。

较有前途的2.5代修饰是锁定核酸（LNA）。 LNAs核苷酸是一类核酸类似物，其中核糖环被连接2'-O原子和4'-C原子的亚甲基桥“锁定”。LNA显示显着增加的热力学稳定性和增强的核酸识别，是许多分子生物学应用中的有力工具.

反义寡核苷酸的化学修饰

反义核酸药物的药物化学进展 (Ionis)

ASO的应用

在理论上，反义寡核苷酸的潜在应用仅受限于可用的遗传信息。反义寡核苷酸可针对其中抑制蛋白质产生或抑制RNA加工产生治疗结果的任何靶标进行开发。目前，ASOs的临床试验包括使用于治疗神经退行性疾病、类风湿性关节炎、银屑病、肾移植排斥反应、炎症性肠病（克罗恩氏病）、肿瘤、罕见遗传疾病等等。

对于一些神经退行性疾病，通过将反义寡核苷酸一次递送到鞘内（intrathecal）或脑脊液流体（cerebrospinal fluid (CSF)）中，从而能够在脑中广泛分布和被神经细胞摄取，这一独特优势促进了反义寡核苷酸的临床进展。2016年12月23日，Spinraza (nusinersen) 获得FDA批准，用于治疗儿童和成年人脊髓性肌萎缩症（SMA），这是一种罕见且常常致命的遗传疾病，影响肌肉力量和运动。 Spinraza是注入到脊髓周围液体中的注射剂。第一年，每两个月注射一次。之后，用药频率会下降。鞘内注射是Spinraza的独到优势和成功的关键之一，它在脑脊液的直接给药导致即刻较高的药物浓度，从而可以使用较小的剂量，可能使毒性最小化。同时。因为脑脊液和脑实质之间有自由交换，并且由于脑血屏障（BBB），可以防止反义寡核苷酸转运到外周循环中，直接递送到神经系统中可以相对迅速地达到治疗所需药物浓度。而脑脊液中由于核酸酶相对较少，ASO也更加稳定。

同样的道理，对于其它的一些神经相关疾病，ASOs在脑内或鞘内注射可以是一个巨大的，独特的优势。

虽然传统上，ASOs的首要、主要靶点是难治性病毒性疾病和癌症。但ASOs相对于传统小分子或生物大分子药物能够解决的疾病并无特殊优势，比如HCV，癌症等方向。在肿瘤领域，通常ASOs平均只能降解抑制80%左右的蛋白，这个比例对于多数驱动致癌基因来说或许不足以抑制肿瘤细胞的生长，或杀死肿瘤细胞。同时，ASOs不易富集到肿瘤部位，而常常聚集在肝脏、肾脏等组织，带来严重的脱靶毒性。

总体来看，不看好现有的ASOs技术用于癌症领域。

Overview of SMN2 genomic sequence and mechanism of Spinraza™ action. Spinraza™ acts by redirecting splicing from the dysfunctional SMNΔ7 product to the full-length SMN.

ASOs的药代动力学总体特点 (ADMET，2’ MOA, 二代)

以二代ASOs 2’ MOA 化学修饰为例。

吸收（Absorption）：没有口服活性，可以静脉或皮下注射给药。其它的给药方式还包括直接肺部给药，玻璃体（intravitreal），鞘内，皮内等给药方式。鞘内给药方式对神经相关疾病是一大优势。

分布（Distribution）:与血浆蛋白高度结合，可快速分布到肝脏，肾脏（肾脏>肝脏>脾脏>骨髓），到达其它器官较少，不能穿过血脑屏障。随着在组织中的积累，谷浓度（C_trough）会有所增加。

代谢（Metabolism）：由内，外核酸酶切割降解成小核苷酸片段。不同实验动物间无差异。对CYP450 没有诱导或抑制作用。对转运蛋白没有抑制作用。没有与代谢相关的药物相互作用。

排出（Excretion）：主要通过泌尿系统排出。

毒理（Toxicity）：没有QT延长毒性（QT prolongation）。

药物动力学（PK）：不同动物模型之间的血浆清除速度（Plasma clearance rate）与体重呈线性正相关。物种之间代谢差异小。

PK/PD：支持较低剂量，较长的给药间隔（如20mg/月或2个月）。

总体而言，ASO的药代非常有规律，物种之间差异小，相对比较单纯。也是一大优势。

机会与挑战

随着下一代ASOs在临床应用方面的快速发展，该技术可以在不久的将来对许多神经和代谢疾病的治疗产生重要影响。

至于ASOs在肿瘤、抗病毒等领域的应用，虽然有众多药物候选进入或即将进入临床，但前景不是非常乐观。

基因疗法在不久的将来会给ASOs带来不小的挑战。比如来自SMN1基因治疗早期临床试验的取得巨大进展，SMA患者可能会出现额外的治疗选择。Avexis 资助的15名患者的临床试验初步结果非常积极，所有15 名患儿均活过20个月，相比历史数据仅为8%。临床结果发表在2017年底NEJM上。这对患者而言是一个巨大的喜讯，而对反义核酸技术就不是很友好了。

总之，ASOs利用自己的独特优势，可以解决小分子及大分子药物难以解决的一些疾病，是一种非常有益的替代药物形式，前景看旺。

参考文献：

1. Nusinersen versus sham control in in fantile-onset spinal muscular atrophy. Finkel, R. S.et al. N. Engl. J. Med. 2017,  377,1723–1732.

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3. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Groen EJN,Talbot K, Gillingwater TH. Nat Rev Neurol. 2018, Feb 9. doi:10.1038/nrneurol.2018.4. Review. [Epub ahead of print]

4. Antisens eoligonucleotides: the next frontier for treatment of neurological disorders. Rinaldi C, Wood MJA.  Nat Rev Neurol.2018 Jan;14(1):9-21. doi: 10.1038/nrneurol.2017.148.

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6. Howthe discovery of ISS-N1 led to the first medical therapy for spinal muscular atrophy. Singh, N. N., Howell, M. D., Androphy, E. J. & Singh, R. N. Gene Ther. 2017, 24, 520–526.

7. Regulation of mRNA translation in neurons — a matter of life and death. Kapur, M.,Monaghan, C. E. & Ackerman, S. L. Neuron. 2017,  96, 616–637.

8. Single-dose gene-replacement therapy for spinal muscular atrophy. Mendell, J. R.et al. N. Engl. J. Med. 2017, 377, 1713–1722.

本文独家首发于微信公号《药时代》（原《医药研发社交平台》）。

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作者： 紫薯

出处： 药时代（ID：drugtimes）

编辑：Walker   配图：网络

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